세포 내 RNA를 연구하는 방법

세포 내 RNA를 연구하는 방법에 대해 알아보자!!

 

 

생체 실험에서 RNa 대사를 연구하는 데에는 몇 가지 방법이 있다. 이 방법들은 대개의 경우 배양액 속에 3H 또는 14C로 표지 된 우리딘을 첨가시켜 방사능을 띤 RNA를 만드는 것이다. 그러나 우리딘은 시토신이나 티민으로도 대사 될 수 있으므로 방사능을 띤 DNA도 생산할 수 있다. 이것은 RNA 대사를 연구하는 데에는 대단히 중요한 문제이다. 왜냐하면 RNA를 세포로부터 분리할 때는 DNA도 항상 섞여 나오기 때문이다. 그러나 DNase를 처리함으로써 섞여 있는 DNA를 제거할 수 있다. 이효소는 DNA를 단일 뉴클레오타이드나 작은 올리고 누클레오 타이드로 분해하여 RNA로부터 쉽게 제거되도록 해 주기 때문이다.

 

생체 실험에서 RNa에 관한 대부분의 연구는 특정 mRNA의 존재 합성 및 분해에 관한 것이다. 이러한 분석을 수행하기 위하여 어느 특정 RNa를 다른 모든 RNA와 구별할 필요가 있다. 이것은 보통 DNA-RNA 혼성화에 의해 이루어진다. 이 기술은 특정 RNA에 상보적인 염기 서열을 가진 DNA를 니트로셀루로스로 만든 여과지에 아래 사진과 같은 방식으로 고정한다. 그런 다음 이 여과지를 방사능 RNA를 가진 추출물 속에 넣고 재생 좋건을 만들어 준다. 그러고 나서 반복하여 씻음으로써 DNA-RNA 혼성체로 존재하지 않는 RNA는 제거한다. 따로 여과지에 남아 있는 방사능의 양은 추출물 속의 특정 RNA의 양이 된다.

 

혼성화 실험에 사용되는 DNA를 얻는 데는 여러 가지 방법이 있다. 가장 유용한 방법은 특정 RNA에 상보적인 염기서열을 갖는 DNA의 토막을 유전공학적 방법으로 RNa와 공통서열이 없고 쉽게 정제되는 외부 DNA 조각 속으로 삽입시키는 것이다. 이 경우 DNA 조각은 클로닝 되었다고 한다. 전형적인 외부 DNA로는 플라스미드 파아지와 바이러스의 DNA가 이용된다. 혼성화 과정에 사용되는 클론 된 DNA 서열을 갖고 있는 DNA 분자를 탐침이라 부른다. 유사하게 RNA도 혼성화 실험에 사용되며 마찬가지로 탐침이라고 부른다.

 

가장 일반적으로 사용되는 기술은 Southern transfer 또는 Southern blotting 방법으로 수많은 DNA 단편들을 동시에 혼성화를 실시하는 방법이다. 이 방법에서는 먼저 어떤 생물의 DNA 전부를 특정 염기서열 사이를 자르는 제한효소로서 여러 단편으로 자른다. 그리고 각 단편을 젤 전기영동에 의해 분리하고 혼성화를 이 모든 단편에 대해 행한다. 여러 가지 방법으로 탐침이 붙은 특정 단편의 위치를 밝힐 수 있으며 그 과정은 다음과 같다.

 

DNA를 효소로 자른 후 아가로스 젤 전기영동에 의해 분리한다. 전기영동이 끝난 후 젤을 변성화 용액에 담그어 젤 속의 모든 DNA를 혼성 체화에 칠요 한 외가닥 DNA로 바꾸게 한다. 변성 과정을 거친 보통 넓은 판 모양의 젤을 니트로셀룰로스 여과지 위에 놓는다. 변성된 DNA는 이 여과지에 강하게 결합한다. 젤과 니트로셀룰로스가 바짝 붙어 있으면 DNA 확산이 크지 않으므로 여과지의 DNA 위치와 젤에서의 위치는 일치한다. 혼성화 과정에서 DNA가 여과지에 붙어 있도록 니트로셀룰로스 여과지를 진공 상태에서 건조되는 것을 막기 위해 단단히 밀폐된 플라스틱 통에 넣어서 몇 시간 동안 적당한 온도로 유지시켜 혼성화시킨다. 그러고 나서 여과지를 꺼내어 씻어서 부착되지 않은 방사능 분자를 제거하고 말려서 X-선 필름으로 자기 방사시킨다. 필름의 검은 부분은 방사능 탐침의 염기서열과 상보적인 서열을 가진 DNA의 위치를 나타낸다. 만약 각 단편에 포함된 유전자가 알려져 있다면 이로써 특정 mRNA에 해당하는 유전자를 확인할 수 있다. 필름의 흑화 정도는 정량적으로 쉽게 측정되며 혼성화된 RNa의 양에 비례하게 된다. 따라서 각 유전자에서 전사된 mRNA의 양을 측정할 수 있다. 이 기술에 의해 여러 다른 mRNA 분자를 동시에 연구할 수 있게 된다. 이 Southern 이동 방법은 특히 DNA-DNA 혼성화 분석처럼 다른 용도가 많다.

 

 

 

 

미래의 실질적 응용

 

바이러스 감염에 사용되는 전통적인 약물 치료를 대체하는 한 방법으로 바이러스의 대사를 교란하기 위해 역의미 올리고 누클레오 타이드를 이용하는 것을 많은 연구자들이 연구하고 있다. 역 의미 올리고 누클레오 타이드란 단백질을 암호화하는 DNA 가닥 또는 mRNA에 상보적인 염기 서열을 가지는 핵산을 말한다.

 

살아있는 세포에서 한 유전자의 역의미 올리고 뉴클레오타이드는 해당 유전자에 상보적인 염기 서열을 가지고 있으므로 그 유전자에 결합을 하여 RNa 중합 효소에 의한 전사를 방해한다. 같은 방법으로 이 올리고 누클레오 타이드는 mRNA에 결합하여 해독을 방해할 수 있다.

 

바이러스가 감염된 시험 포유동물 세포에서 겨우 12개 정도의 누클레오타이드의 짧은 올리고 누클레오 타이드로 특정 유전자의 전사나 해독을 효과적으로 억제할 수 있음이 입증되었다.

 

이 방법의 중요한 이점은 약물 고안에 합리적 접근을 시도할 수 있다는 것이다. 즉 일단 목표가 되는 핵산의 염기 서열을 알면 왓슨-크릭 염기쌍 형성의 규칙에 따라 원하는 올리고 누클레오 타이드를 고안할 수 있다. 이 방법의 또 다른 장점은 고유성이다. 올리고 누클레오 타이드는 목표가 되는 특정 유전자에만 결합하므로 다른 주요 대사 기능을 교란하지 않을 것이다. 또 한 가지 장점은 비교적 쉽게 올리고 누클레오 타이드를 합성할 수 있으므로 짧은 시간 내에 실험 시도가 가능하다는 점이다.

 

이 새로운 방법에도 단점은 있다. 그 중 주요 문제는 세포 내로의 약물 전달에 관한 것으로 포유동물에 올리고 누클레오 타이드를 투여하는데 따르는 어려움으로 보통 이러한 화합물은 세포 내로 침투가 되지 않으며 일단 들어가더라도 세포 내의 RNase에 의해 분해가 되기 쉽다. 이와 같은 어려움에도 불구하고 지질 소낭 혹은 수송 단백질의 이용 또는 RNase에 분해되지 않는 올리고 뉴클레오타이드의 고안 등 새로운 투여 방법이 사용되면 이와 같은 문제는 해소될 수 있으리라 예상된다.