원유 및 발효유의 세균 수 측정 ( Spreading & Pouring )

원유 및 발효유의 세균 수 측정 실험

 

 

Introduction

 

미생물에 의한 원유(raw milk)의 오염과 그 방지는 우유 및 유제품의 처리 가공과 그 품질관리 면에서 매우 중요하며, 원유의 미생물 오염 정도는 최종제품의 품질을 근본적으로 좌우하게 된다. 원유의 미생물 오염은 젖소의 유방내에 침입된 미생물 또는 착유 과정 및 집유 과정에서의 오염이 주요한 것들이다. 원유내의 미생물은 주로 그람양성균과 그람음성균이며, 그 외에도 효모(yeast), 곰팡이 (mold) 등이 존재할 수 있으며, 이들 균은 유제품에 나쁜 영향을 미치게 되므로 위생적인 측면과 유제품의 품질 보장을 위해서도 원유 중 세균수를 엄격히 규제해야 한다. 따라서 원유의 세균수 검사는 우유의 생산과 저장 과정 중의 위생상태를 평가하고, 살균 후 생존하는 미생물이 유제품의 품질에 미칠 영향을 판단하기 위해서 반드시 수행 되어져야 하는 과정이다.

 

 

 

Principle

 

각종의 미생물은 각자의 가장 적합한 주위 환경 조건에서 생육한다. 자연계에서는 각종 미생물들이 혼재하여 생육하고 있는데 미생물 연구에 있어서는 특정 활성을 나타내는 미생물이 어떤 것인지를 알아내야 하기 때문에 개개의 미생물을 단독으로 분리하여 한 종류의 미생물만 배양하는 순수 배양을 하는 것이 중요하다. 하지만 세균은 너무 작아 미세 조작기구가 없으면 직접 분리할 수 없기 때문에 간접적인 분리 방법을 사용한다.

 

현재 세균을 분리하기 위해서는 streaking, spreading, pouring의 3가지의 희석법을 사용한다.

 

- Dilution

1870년대 Lister는 최종적으로 희석된 시험관에는 하나의 세균만이 존재할 것이라는 생각으로 연속희석법 (Serial dilution)을 사용하여 순수 배양을 시도하였다. 그러나 오염이 되는 등 극히 제한된 균만을 분리하였다. 1880년 Koch는 소체배지를 사용하였고 그 후 희석에 의해 고체배지 상에서 세균을 분리할 수 있게 되었다. 분리된 세균은 고체 배지 상에서 생육하여 눈으로도 볼 수 있는 colony를 형성한다.

 

- Spreading

도말평판법이라고 불린다. 보통 병원성 균의 정량 실험을 할 때 배양 후 생성된 colony의 수를 정확히 계수하기 위해 얇게 펴 발라서 접종하는 방법이다. 희석된 시료를 소량 취해서 고체 배지의 표면에 넣고 spreader를 이용하여 도말한다.

 

- Pouring

주입평판법이라고 불린다. 시료를 여러 번 희석하여 각각의 희석 액을 소량 취해서 용해된 각각의 고체 배지와 혼합하여 petri dish위에 붓는다. 이때 몇몇 petri dish에서는 분리된 균락이 형성된다.

 

 

 

Materials & Methods

 

1) Preparation or Materials

 

① reagent : MRS, BCP, PCA 배지

② apparatus : spreader, 삼각 flask, pipet, incubator, petri dish

③ sample : 원유, 발효유, 농후 발효유

 

 

2) Methods

 

- Spreading

1. Plate에 부어 굳힌 후 표면을 말려놓은 배지(PCA, MRS, BCP)를 준비한다.

2. 알코올로 spreader를 소독하고 화염멸균 시킨 후 식혀놓는다.

3. petri dish의 겉에 배지종류, sample종류, 실험자, 희석 승수를 표시한다.

4. Sample이 들어있는 tube를 vortexing, inverting한 후 pipet으로 추출한다.

5. 추출한 sample을 고체 배지 중앙에 분주한다.

6. spreader를 이용하여 petridish와 spreading방향을 다르게 돌려가며 spreading한다.

7. 뚜껑을 닫고 뒤집어 놓은 채 37℃ incubator에서 약 48시간 배양시킨다.

 

- Pouring

1. MRS 배지를 액체상태로 녹여서 준비한다.

2. petri dish의 겉에 배지종류, sample종류, 실험자, 희석 승수를 표시한다.

3. petri dish에 sample을 100ml추출하여 접시 중앙에 분주한다.

4. 액체 상태의 MRS배지가 담긴 삼각 flask의 입구를 화염 멸균 후 20ml정도 기포가 생기지 않게 petri dish에 붓는다.

5. petri dish의 뚜껑을 닫고 살살 돌려가며 배지와 sample을 잘 섞어준다.

6. 37℃ incubator에서 약 48시간 배양시킨다.

 

 

 

Result

 

- 원유 : PCA배지

 

 

 

 

 

- 발효유 : MRS배지

 

 

 

 

 

 

 

 

- 발효유 : BCP배지

 

10-5 희석 배수의 배지이다. colony가 자란 일부분이 노랗게 색이 변했다. 미생물의 작용한 부위에서 pH가 떨어진 결과 보라색이 노란색으로 변하였다.

 

 

 

 

 

- 농후발효유 : MRS배지, Spreading

 

 

 

 

 

 

- 농후발효유 : MRS배지, Pouring

 

 

 

 

 

 

Discussion

1) 실험 결과를 바탕으로 실험에 사용한 발효유 1ml당 미생물 수를 계산하시오.

 

- 발효유 (MRS)

 

 

→ 발효유 1ml 당 미생물 수는 유효 카운팅 개수를 충족하는 희석승수 의 CFU/1ml 값 의 평균인 2.05×10 CFU/1ml 이다.

 

2) 실험에 사용된 각 배지의 특징에 대해 조사하시오.

 

배지는 사용목적에 따라 선별배지와 분별배지로 나누어진다. 선택배지(selective medium)는 특정 미생물을 선택적으로 배양하기 위해 그 미생물만 이용할 수 있는 영양물질(항생제, 염료, 탄소원)을 포함하여 만든 배지이며, 분별배지(differential medium)는 특정 미생물을 다른 종류의 미생물과 구별하기 위해 배지에 특수한 생화학적 지시약을 넣어 만든 배지이다.

 

① PCA

Plate Count Agar. Standard Methods Agar(SMA)라고 부르기도 한다. 이 배지는 미생물의 성장배지로 일반적으로 sample내의 생균수, 중온성, 호기성 균수 측정에 이 배지를 사용하고 있다. 이것은 분별배지나 선택배지가 아니며 PCA 배지의 구성은 주로 0.5% peptone, 0.25% yeast extract, 0.1% glucose, 1.5% agar 이며, 25℃에서 pH 중성이다. 우리나라에서도 식품위생법의 고시에 근거한 시험법으로 포도당 한천배지, 플레이트 카운트(plate count)배지 등 수 종류의 한천배지가 사용되어 왔지만 현재는 표준한천배지로 통일되었다.

 

② MRS

De Man, R ogosa and Shape Agar의 약자로 개발자들의 이름을 따서 지은 이름이다. 선ㅌ택 배지의 하나이며 Lactobacilli의 성장을 촉진한다. 1960년에 개발되었다. MRS배지는 1.0 % peptone, 1.0 % beef extract, 0.4 % yeast extract, 2.0 % glucose, 0.5 % sodium acetate trihydrate, 0.1 % polysorbate 80 (also known as Tween 80), 0.2 % dipotassium hydrogen phosphate, 0.2 % triammonium citrate, 0.02 % magnesium sulfate heptahydrate, 0.005 % manganese sulfate tetrahydrate, 1.0 % agar로 구성되어 있다. 25℃에서 6.2 pH이다. 특히 Lactobacilli가 아닌 다른 competing bacteria의 성장을 억제하는 sodium acetate를 함유한다. 갈색을 띄는 배지이다.

 

③ BCP

place count agar with BCP(bromocresol purple). PCA 배지에 4%의 식염과 0.004~0.006%의 BCP(bromocresol purple)를 가한 것이다. BCP배지는 Extract Yeast Dried, Peptone, Glucose, L-Cysteine, Tween 80, Bromcresol purple, agar powder등으로 구성된다. BCP배지는 pH indicator이며 선택배지로서 보라색을 띄는데 이 배지에서 자라는 유산균은 glucose를 이용하여 lactic acid를 만들어내는데 이때 colony의 주위가 산성이 되어 배지의 색이 노란색으로 변한다. 발효유 유산음료 및 유산균을 함유하는 아이스크림 등 유산균을 첨가한 분말청량음료에서의 세균 수 검사에서는 4% 염화나트륨을 함유한 BCP 플레이트 카운트 한천배지를 사용하고 있다.