반추위에서 생산되는 암모니아!!(NH3-N Analysis)에서 질소원 측정하기

반추위에서 생산되는 암모니아로부터 질소함량을 분석해 보자!!

 

 

1. 실험 목적

 

반추 동물의 제 1위에서 채취한 미생물로 반추위와 같은 환경을 인공적으로 만들어 시료를 발효 시키고, 위에서 분비되는 pepsin 용액으로 48시간 동안 배양시켜 시료의 중량 감소로 Dry Matter, NDF, ADF 및 Celloulose등의 소화율을 측정할 수 있는데 이를 in vitro 방법이라 한다. 이 방법을 이용하여 반추 동물이 섭취한 사료 내의 단백질은 제 1위에서 서식하는 미생물에 의해 암모니아로 변화된  다음 미생물 단백질로 합성이 되어 이용되거나 암모니아 자체가 체내로 흡수된다. 따라서 사료 내의 암모니아는 반추 동물이 이용할 수 있는 주된 질소원이고 그것을 정량 분석하여 섭취한느 사료의 질소원의 양을 측정한다. Glutamine←NH3 +ATP

 

 

 

2. 재료 및 방법

 

1) 재료

 

Spectrophotometer, microcyringe(200p.1000p), centrifuge, vortex mixer, oven, pH meter, test tube(20ml), water bath 등

 

 

2) 방법

 

1. NH3-N Analysis에서는 Phenol color reagent, alkali-hypochlorite reagent, standard ammonia-nitrogen 시약을 사용한다.

 

2. Test tube(15ml)에 sample 0.02ml, standard 용액 0.02ml, D.W 0.02ml를 준비한다. 각각의 용액에 1ml phenol color reagent와 1ml alkali-hypochlorite reagent를 첨가한다.

 

3. Vortexing 후 Water bath (50℃) 에서 7분동안 배양하여 발색 시킨다. D.W 8ml를 각각의 test tube에 첨가 후 vortexing한다. 이 때, 파란색이 진할 경우에는 D.W를 16ml를 넣어주도록 한다.

 

4. Spectrophotometer를 미리 가동하여 630nm에 고정하여 D.W 용액을 기준으로 가장 낮은 농도의 standard 부터 OD를 측정한다. 이후, sample들의 OD를 측정한다.

 

 

 

 

3. 결과

 

 

 

 

 

4. 고찰

 

반추동물은 단백질을 섭취하게 되면 제 1위의 미생물에 의해 분해되어 암모니아로 변화된 다음 미생물단백질로 합성이 되어 이용되거나 암모니아가 체내로 흡수된다. 제 1위에 서식하는 미생물이 암모니아를 질소원으로 하여 스스로 단백질을 합성할 수 있기 때문에 암모니아가 반추위 동물에게 중요하다. Centrifuge는 사료 샘플을 가라않힐 수 있다. Standard ammonia-nitrogen 용액은 수분을 포함하면 N이 작게 나올 수 있기 때문에 수분을 다 제거해야 한다. rumen내에 흡수된 단백질의 50%정도는 암모니아로 전환되고 나머지는 소장으로 bypass되어 소화 흡수된다. 사료를 급여할 때 반추위내에서 소화되지 않게 단백질원은 가공처리하고 반추위내 미생물을 위해 NPN(Non-protein Nitrogen)을 첨가해 준다.

 

in vitro 환경에서 실험을 하면 특정 사료를 첨가했을 때 미생물이 leg phase까지 증식하는 시간과 그 양, 그 후에 기질이 고갈되고 증식이 정지되고 암모니아 양이 다시 증가되는 정도를 파악하여 사료내 단백질이 얼마나 잘 아미노산으로 전환되는지 , 전환된 양은 얼마나 되고 미생물이 어떻게 이용하는지 파악할 수 있다. 비단백태질소화합물(non-protein nitrogen compound; NPN)이란 가수분해에 의하여 아미노산으로 전변되지 않고 단백질과 같은 목적으로 쓰일 수 있는 질소화합물로 종류로는 amide, amino acid, nitrogenous glucoside, ammonium salt, alkaloids, 및 nitrate 등이 있다. NPN은 성장 중인 목초에 많이 포함되어 있으며, 반추동물의 경우에는 단백질 공급원으로 이용될 수 있다. 분해되어 아미노산을 생성하는 단백질을 순단백질이라하고 NPN과 순단백질을 총칭하여 조단백질(Crude Protein)이라고 한다.