시료 중 단백질 함량 측정하기, 실험(Lowry method)

시료에 존재하는 단백질의 함량에 대해 측정해보자!

 

 

1. 서론

 

용액 상태 또는 고형물 상태의 시료 중의 단백질을 측정할 수 있으며, 상당히 예민하기 때문에 5㎍의 단백질까지 측정할 수 있다. Alkaline Copper가 단백질 중의 tryptophan 및 tyrosine과 작용해서 생기는 청색의 농도는 단백질의 함량에 따라 좌우되므로 이것을 기준으로 하여 단백질의 함량을 결정하는 것이다.

 

 

2. 재료 및 실험 방법

 

1) 재료

spectrophotometer, pipette, 갈색병, test tube, 등

 

2) 방법

 

1. 가용성 단백질을 test tube에 25~500㎍의 단백질을 함유하는 용액 1.0ml에 알칼리 동용액 5ml을 가하여 잘 섞어서 10분 이상 실온에 방치한다.

 

2. 시약 folin-ciocalteau phenol을 0.5㎖ 빨기 가하여 섞은 후 30분에서 2시간 방치한 후 spectrophotometer 660㎚에 고정하여 Optical Density(OD)를 읽는다.

 

3. 불용성 단백질의 경우 침전된 단백질(25~500mg)에 1L NaOH용액 1.0ml을 가하고 방치시킨 후 시약 동탄산 용액을 가하여 방법 2와 같이 조작한다.

 

4. Calibration curve: 상기와 똑같은 방법으로 0. 24, 80, 120및 200㎍의 시약 ①를 시료와 똑같이 처리하여 calibration curve를 만든다.

 

 

 

3. 실험 결과

 

 

 

 

 

 

4. 고찰

 

Lowry method는 1950년대에 Malcolm Lowry가 고안해낸 단백질 함량 분석법이다. Lowry method의 실험 원리는 2개 이상의 peptide 결합이 근접하여 존재할 때 강알칼리 상태에서 2가 구리이온과 착염을 형성해 발색한다. 또한 amino acid 중 Tryptophan과 Tyrosine은 folin reagent을 환원시켜 청색으로 발색한다. 이 발색 반응을 이용해 protein 및 peptide를 정량화한다. 정량을 위해서는 농도를 알고 있는 단백질 표준 용액을 농도별로 만들어 사료와 동일한 조건에서 발색시킨다. 발색의 강도는 protein의 농도에 비례하므로 시료의 발색 정도와 단백질 표준 용액의 발색 정도를 비교하여 시료에 들어 있는 단백질의 양을 결정한다. Lowry-Folin method는 신뢰성이 있으며 protein 종류에 따른 차이가 적은 것이 장점이다. 하지만 reaction을 방해하는 물질이 다수 존재하며 반응시간이 느리고, 일부 reagent가 불안정하다. 또한 비가역 변성 반응을 일으키므로 시료의 재사용이 불가능하다는 단점이 있다. 또한 표준 곡선을 결정하는 데 사용한 단백질이 나타내는 색의 세기와 다를 수 있다. 그럼에도 불구하고 이 방법은 단백질을 정제하는 과정에 있어서 단백질의 함량 변화를 측정하는 데는 매우 유용한 방법이다. 발효가 많이 된 것은 미생물이 많다는 것을 보여준다. 그리고 단백질이 많으면 미생물이 많다는 것이다.