발생공학 대표적인 4가지 실험 소개

발생공학적 대표적인 실험을 4가지

 

 

1. Magnetic activated cell sorting (MACS)

 

 

 

 

이 실험은 정원 줄기세포를 추출하기 위한 실험 방법이다. 원래는 태어난 지 7~9일경의 정원 줄기세포를 채취하지만, 실험에서는 성체의 정원 줄기세포를 채취한다. 우선 쥐를 경추 탈골 법을 이용해 죽인다. 경추 탈골 법은 엄지와 검지로 쥐의 경추를 잡고 꼬리를 잡아당기는데 이때 경추 1번과 2번이 탈골되면서 신경다발이 끊겨 죽게 된다.

 

그리고 수술용 집게와 가위를 내피용과 외피용 2개를 준비해서 미생물에의한 오염을 최대한 막는다. 수술부위를 알코올로 소독한다. 그리고 정소를 꺼낸다. 정소는 지방으로 쌓여있어 외부로부터 충격을 완화시킨다. 정소안에는 세정관이 존제하는데 백막에 둘러싸여 있다. 그래서 정소 내 세정관 주변 유선조직을 분리하기 위해 콜라 게 네이즈 효소처리를 하고 waterbath에 넣어준다. (40도에서 30분 처리) 그러면 세정관 주변 섬유조직이 녹는다.

 

효소활성을 멈추게 한 뒤 물 5ml를 넣고 원심분리를 한다.(1680 rpm 600g) 가라앉은 세정 관부 분만을 채취한다. 트립신과 dnase1을 4:1 비율로 섞어서 세정 관부분에 처리하면 세 정관 밖의 세포들을 제거된다. 그래서 waterbath처리를 해준다.(5~10분/36~37도) 그러나 우리는 실험을 빨리 끝내기 위해 77도에서 처리했다. 처리 후에, 트립신 효소 기능을 정지하는 제제 FBS(소태아 혈청)을 넣고 효소 활성을 정지시킨다. Dnase1은 기능을 정지하는 제제가 없어서 dmem으로 희석해서 분리해준다. 4도에서 mesh처리를 하고 thy-1 marker처리 후 MACS실험기구를 이용해 정원세포는 자석에 붙고 나머지 세포들은 떨어져 내려간다. 그 뒤에 수압을 이용해서 자석에 붙어있던 정원세포를 추출해낸다.

 

 

 

 

2. Immunocytochemistry (ICC)

 

 

항원항테가 일이 키는 반응에서 예민성과 특이성을 이용해서 조직 내의 단백질이 세포 내에서 만들어지며 그 단백질에 대한 생성물질을 검출하는 염색법이다. 실험 단계로는 첫 번째로 Fixing, 두 번째로 permeblity 세 번째로는 blocking이 있다.

 

➀ Fixing- 세포나 조직의 형태학적인 관찰을 원활하게 하려면 고정시키는 과정이 제일 중요하다. 이상적인 고정은 세포 내 소기관의 형태가 완전히 유지되면서 항원성을 잃지 않는 것이다. 4% PFA를 5분 동안 처리해주어 형상유지할 수 있도록 세포를 고정시켜준다.

 

➁ permeblity- trition-x100처리를 하여 막의 투과성을 높여 안티 바디가 세포 안으로 잘 들어가서 염색이 잘되게 한다.

 

➂ blocking- 5% BSA가 붙어서 상온에서 30분 이상 블록킹을 시켜준다. 안티 바디가 불특정 단백질과 붙지 못하도록 해주기 위해서 그렇게 사용한다.

 

이 세 가지 단계가 끝나면 12시간 동안 4도에서 보관해준다.

 

그리고 DAPI는 모든 세포의 핵을 파란색으로 염색시켜준다. 처음에, 글라스에 리퀴드 불 로커로 세포를 넣을 정도로 크기를 조절해준다. 그래서 파이펫을 이용해서 인엔아웃을 하고 세포를 넣어준다 인큐베이터에 20-30분 동안 넣어준다. 그리고 커버글라스로 덮어주고 공기가 잘 들어가지 않도록 매니큐어로 겉을 칠해준다. 현미경으로 관찰할 때는 플라스미드를 뒤집어서 관찰한다. 그 이유는 유리가 두께가 얇은 쪽으로 보는 것이 세포가 더 잘 보이기 때문이다.

 

 

 

3. Transplantation

 

 

 

이 실험은 정원 줄기세포의 기능과 활성을 볼 수 있다. Transplantation은 이식기법으로 Donor cell이나 조직을 다른 동물로 이식하는 것을 말한다. 이번 실험에서는 mouse로부터 채취한 정원 줄기세포를 다른 recipient mouse에 정소 내로 이식한다. micropipette을 만들기 위해서는 파이펫을 고정을 시켜 열을 이용해서 끝을 뾰족하게 만든다.

 

그 뒤 끝부분을 살짝 부시고 부신 파이펫을 글라인더를 이용해 미세하게 갈아준다. 그때 알콜을 결합시켜주면서 뿌리면서 한다. 만들어진 마이크로 파이펫의 한눈금은 십마이크로미터이다. 파이펫를 준비했으면 쥐에게 마취를 한다. 마취제를 오백마이크러미터 복강주사로 넣는다. 수술할 부위의 털을 밀어준다. 그 뒤에 알코올로 닦아준다. 이때 수술용 가위와 집게를 2개씩 준비해서 외피와 내피의 미생물로 인한 오염이 없게 한다. 먼저 외피를 잘라낸다.

 

그다음 내피를 잘라준다. 안에 정소를 꺼낸다. Duct자리까지 만든다. 불어서 세포를 정소안에다가 넣는다. 정자가 나가는 동시에 파란색으로 염색시킨 세포도 나간다. 정소를 다 봤으면 다시 정소를 넣어주고 수술부위를 잘 꿰매 준다.

 

 

 

 

4. STO cell subculture

 

 

 

 

이 실험의 목적은 정원 줄기세포를 키우기의해 STO cell를 깔아줘야 하는데 배양을위해 걷고 카운팅을 해서 깔아주는 실험이다. STO cell은 바닥에서 붙어서 자라는 세포이다. 그리고 정원줄기 세포는 STOcell 위에서 자란다. 그래서 배양액은 필요 없다. 바닥에 붙은 STO cell를 때 주기 위해 트립신을 넣어준다. (1mn) 배양액 뚜껑을 닫고 톡톡 쳐준다. 트립신 처리를 하면 바닥에 붙은 세포가 떨어져 움직인다. 그러나 세포에도 손상을 줄 수 있어 비활성 시키기 위해 FBS를 트립신의 10% 넣어준다. 파이펫을 이용해 STO DM을 넣어준다. 세포를 떨어트리려면 더 많은 양이 필요하기 때문에 1mn을 넣어준다. 5번 정도 반복해서 세포를 떨어트린다.

 

그리고 원심분리를 통해 배양액(트립신+FBS)을 분리해주고 살아있는 세포와 죽어있는 세포를 구분해주기 위해 트리판 블루로 염색해서 염색이 된 것은 죽은 세포이다. 그리고 염색이 되지 않은 세포는 살아있는 세포로 구별한 후 카운팅 챔버를 통해 세포수를 확인하고 원심분리를 해준다. 그러면 바닥에 세포가 모여 있게 되고 그것을 dish에 넣어서 배양해주면 된다.